Около середины XIII века Гродно и Гродненское княжество вошли в состав Великого княжества Литовского.
Примерно в 1300 году каштеляном (старостой) Гродненского замка стал легендарный Давыд Городенский. Он успешно отражал все атаки на город и не потерпел ни одного поражения в битвах с крестоносцами.
Гродно был резиденцией литовских князей и польских королей. В 1391 году от великого князя Ягайло город получил малое (неполное) магдебургское право (то есть городское самоуправление), в 1398-м великий князь Витовт сделал его «второй столицей» Великого княжества Литовского и лучшим, после Вильно, городом княжества. Именно Витовт построил в конце XIV – начале XV века в Гродно каменный замок.
При Стефане Батории для города наступили славные времена: он стал королевской резиденцией и фактически столицей Речи Посполитой. В XVI–XVIII веках здесь проходил каждый третий сейм.
Уникальным даже для Европы явлением стали годы правления в Гродно старосты Антония Тызенгауза, в 1764 году начавшего строительство «идеального» города и основавшего в Гродно и его предместьях 20 крупных мануфактур (суконную, мебельную, табачную, оружейную, каретную и др.). При нем в Гродно существовала медицинская академия (по сути, первый белорусский вуз), открылся первый театр. Этому времени посвящена экспозиция в последнем сохранившемся «доме ремесленника», который сейчас превращен в музей.
В гродненском Новом замке в мае 1793 года прошел так называемый «немой», или «молчальный», сейм, на котором был утвержден второй раздел Речи Посполитой. Здесь же после неудачного восстания последний король Речи Посполитой Станислав II Август Понятовский отрекся от короны. В 1795 году, после третьего передела Речи Посполитой, территория современной Гродненской области вошла в состав Российской империи.
Во время Великой Отечественной войны город, к счастью, пострадал не так сильно, как другие белорусские города.